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Amplex Red是一种灵敏度高，稳定性好的过氧化氢探针，也是一种过氧化物酶的荧光底物。在HRP中，的Amplex Red与过氧化氢以1:1进行反应，产生具有高荧光的试卤灵。由于和很多不同的酶反应都会产生过氧化氢，因此Amplex Red可以用来检测各种酶的活性。

1. 工作液配制：
   
   1. 250×Amplex Red储液：储液应当避免反复冻融，避光保存。
      
   2. 制备1×Amplex Red过氧化物酶工作液：建议在实验当天制备。室温解冻Amplex Red储液，以含200μM H2O2的50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0或者以您实验中所用的合适缓冲液将250×储液稀释至1×。
      注意：在有硫醇类物质如：DTT或β-巯基乙醇，该类物质终浓度大于等于10μM，可以显著地降低试剂的动态范围。NADH和谷胱甘肽(还原型GSH)也可能会影响到本试剂盒。
2. 在上清液检测体系中操作本试剂盒：
   
   1. 加50μL以上步骤制备的1×Amplex Red过氧化物酶工作液至各个孔中(包括：酶标准孔、空白对照、样品测试孔)，确认每孔的总体积为100μL。
      注意：对于384孔板来说，每孔加入25μL的样品和25μL的Amplex Red酶工作液。
      
   2. 室温避光孵育10～30分钟。
      
   3. 检测荧光读数的增加(Ex/Em=571/565nm)
      
   4. 以空白孔(仅有缓冲液)为荧光对照孔，以其他孔的读数减去空白对照值。

1. 准备Amplex Red-双氧水(H2O2)工作液：
   
   1. 250×Amplex Red储液：储液应当避免反复冻融，避光保存。
      
   2. 制备1×Amplex Red-H2O2工作液：建议在实验当天制备。室温解冻Amplex Red储液，以含0.4units/mL HRP的50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0或者以您实验中所用的合适缓冲液将250×储液稀释至1×。
      注意：在有硫醇类物质如：DTT或β-巯基乙醇，该类物质终浓度大于等于10μM，可以显著地降低试剂的动态范围。NADH和谷胱甘肽(还原型GSH)也可能会影响到本试剂盒。
2. 在上清液检测体系中操作本试剂盒：
   
   1. 加50μL以上步骤制备的1×Amplex Red-H2O2工作液至各个孔中(包括：酶标准孔、空白对照、样品测试孔)，确认每孔的总体积为100μL。
      注意：对于384孔板来说，每孔加入25μL的样品和25μL的Amplex Red-双氧水工作液。
      
   2. 室温避光孵育10～30分钟。
      
   3. 检测荧光读数的增加(Ex/Em=571/585nm)
      
   4. 以空白孔(仅有缓冲液)为荧光对照孔，以其他孔的读数减去空白对照值。